高原地區(qū)空氣稀薄，大氣氧含量低，可誘發(fā)心、 腦、肺等多臟器的缺氧損傷，大腦特別是海馬組 織對缺氧最為敏感。隨著人類在高原地區(qū)的生 活、工作及旅游的日益廣泛，急性高原病、健忘、注意 力不集中、記憶力衰退等，越來越多地困擾著人們的 工作與生活，其嚴重程度與海拔高度、居住時間、海 拔上升速度以及個人體質等密切相關。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物

SPF 級雄性 Wistar 大鼠 144 只，體 重( 200 ± 20) g，購自中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊 第九四〇醫(yī)院動物實驗科，實驗動物許可證號: SYXK( 軍) 2017-0046。飼養(yǎng)室溫度為( 25 ± 2) ℃， 相對濕度為 40% ～ 60% 。所有大鼠標準飼料進行 喂養(yǎng)，自由進水。

1. 2 實驗試劑與儀器

1. 2. 1 實驗試劑

4% 多聚甲醛( Biosharp) ; BCA 蛋 白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、 4 × 蛋白質上樣緩沖液( 含 DTT) 、脫脂奶粉、SDS、 Tris、Glycine、10 × TBST( 以上試劑均購自北京索萊 寶科技有限公司) ; ＲIPA 裂解液和 PMSF( 均購自碧 云天生物技術研究所) ; PageＲuler Prestained Protein Ladder ( Thermo Scientific ) ; Anti-HIF-1α 抗 體-ChIP Grade( Abcam) ; 小鼠 β-actin 單克隆抗體、辣根酶標 記山羊抗小鼠 lgG( H + L) 、辣根酶標記山羊抗兔 lgG( H + L) ( 以上均購自北京中杉金橋生物公司) ; 無水甲醇( 成都市科隆化學品有限公司) ; PVDF 膜( Immobilon-P Transfer Membranes) ; Carestream 醫(yī)用 X 射線膠片( 廈門銳珂醫(yī)療器材公司) ; 通用顯影粉 和酸性定影粉( 均購自天津市世紀奧博商貿(mào)公司) ; WesternBright ECL( A 液和 B 液) ( Advansta ( USA) 公司) 等。

1. 2. 2 實驗儀器

E200 型光學顯微鏡( 日本 Nikon 公司) ; FLYDWC50-ⅡC 低壓低氧動物實驗艙( 貴州 風雷航空軍械有限公司) ; Tissuelyser-24 多樣品組織 研磨機( 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司) ; 3K15 型高 速冷凍離心機( Sigma 公司) ; SpectraMax  i3 型全 自動熒 光 酶 標 儀 ( 美 國 Molecular Devices 公 司) ; BP210S 型電子天平( 德國 Sartorius 公司) ; DK-8A 型電熱恒溫水槽( 上海精宏實驗設備有限公司) ; ErpacTM Basic 基礎電泳儀電源和小型垂直電泳槽、 Trans-Blot  TurboTM Transfer system 半 干 轉 儀 ( BIO-ＲID) 等。

1. 3 實驗方法

1. 3. 1 不同缺氧海拔暴露與分組

選取 72 只 SPF 級雄性 Wistar 大鼠隨機分為常氧空白組 ( 海 拔 1500 m) 、缺 氧 3000 m、4500 m、6000 m、7500 m、 8000 m 組，每組 12 只，常氧空白組置于飼養(yǎng)室( 海 拔 1500 m，蘭州) ，并將缺氧組大鼠按組別放入低壓 低氧動物實驗艙內，以10 m /s的速度分別將艙內海 拔升高到 3000 m、4500 m、6000 m、7500 m、8000 m， 缺氧暴露時間設置為 12 h。缺氧結束后，迅速解剖 取材，檢測相關指標，固定缺氧暴露損傷最嚴重的海 拔高度。

1. 3. 2 不同缺氧時間暴露與分組

當缺氧暴露海拔 確定后，另取 72 只 SPF 級雄性 Wistar 大鼠隨機分為 常氧空白組( 0 h) 、缺氧 6 h、12 h、24 h、36 h、72 h 組，每組 12 只。將缺氧組大鼠按組別放入低壓低氧 動物實驗艙內，以 10 m /s 的速度將艙內海拔升高到 上一組實驗確定的海拔，缺氧暴露時間分別設置為 6 h、12 h、24 h、36 h、72 h。缺氧暴露后立即解剖取 材檢測相關指標，確定缺氧暴露損傷最嚴重的時間。

1. 3. 3 海馬組織樣本采集

不同條件缺氧暴露后立 即將大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉，斷頭處死， 然后各組隨機抽取大鼠 2 只剖取大腦，放入 4% 多 聚甲醛中進行固定，用以制備組織切片。剩余大鼠 剖取海馬組織，按組別分裝標記后于 － 80℃ 冰箱中 存放備用。

1. 3. 4 海馬組織切片的制備

經(jīng)過固定的大鼠大腦 組織標本，進行石蠟包埋后，6 μm 切片，裱于經(jīng)多聚賴氨酸包埋的清潔載玻片上，常規(guī)進行脫蠟、復水、 磷酸鹽緩沖液( PBS) 洗滌及蘇木精 － 伊紅( HE) 染 色，觀察海馬組織的病理形態(tài)。

1. 3. 5 海 馬 組 織 中 HIF-1α 的 蛋 白 表 達

采 用 Western Blotting 法檢測。稱取海馬組織約 50 mg，加 入 500 μl 的 ＲIPA 裂解液( 含 1% PMSF) 提取總蛋 白，并采用 BCA 法測定蛋白濃度。所制備的蛋白樣 品于 － 80℃ 冰箱中存放。取樣品 20 ～ 50 μg 進行 SDS-PAGE 電 泳。濃 縮 膠 濃 度 為 5% ，80 V 電 泳 40 min，分離膠濃度為 10% ，110 V 電泳 80 min，半 干法轉膜，電轉條件根據(jù)目的蛋白分子量不同而進 行設置，β-actin 為 18 V，15 min; HIF-1α 為 20 V， 15 min。轉膜完畢，5% 脫脂奶粉封閉 2 h 后，以 4℃ 搖床孵育一抗過夜，一抗?jié)舛确謩e為 β-actin ( 1 ∶ 1000) 、HIF-1α( 1∶ 1000) 。第 2 天，采用 1 × TBST 洗膜( 共 6 次，每次 8 min) 后，室溫搖床孵育二抗， 二抗?jié)舛葹槔备笜擞浬窖蚩雇没蚩剐∈?lgG( 1∶ 5000) 2 h，再次洗膜，ECL 顯影曝光。

1. 4 統(tǒng)計學方法

應用統(tǒng)計軟件 SPSS 24． 0 處理 數(shù)據(jù); Image-Pro Plus 6． 0 軟件對曝光圖片進行灰度 掃描測定并進行結果分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標準 差( x ± s) 表示，進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的兩 組間均數(shù)比較采用獨立樣本 t 檢驗。α = 0． 05 為檢 驗水準。

2 結果

常氧空白組大鼠海馬組織呈正常 形態(tài)結構，細胞排列整齊、完整，神經(jīng)元輪廓清晰，多 呈圓形，細胞核大而圓，著色較淺，位于細胞中央，細 胞核和細胞質邊界清晰易辨。缺氧組大鼠海馬組織 水腫、疏松; 神經(jīng)元呈不同程度的變性、壞死，以及大 量周圍神經(jīng)空泡; 并且隨著缺氧海拔增高和缺氧時 間延長，海馬組織損傷愈嚴重。7500 m 海拔缺氧暴露對大鼠 海馬組織中 HIF-1α 表達的影響最明顯。故固定缺 氧 7500 m 不同缺氧時間暴露后發(fā)現(xiàn)，各 缺 氧 組 HIF-1α 的表達與常氧空白組相比有顯著性差異 ( P ＜ 0. 01) 。隨著缺氧時間延長，缺氧 6 h 至 24 h 時 HIF-1α 表達呈升高趨勢，缺氧 ＞ 24 h 后 HIF-1α 表達可達到平臺期。

3 討論

本實驗采用低壓低氧動物實驗艙模擬高原環(huán)境，研究不同高原缺氧暴露條件對大鼠海馬組織病 理學及 HIF-1α 的影響; 結果顯示，常氧空白組大鼠 海馬組織結構完整，細胞排列整齊，但是隨著缺氧海 拔升高及缺氧時間延長，海馬組織結構疏松、水腫， 神經(jīng)元呈不同程度的變性、壞死。HIF-1α 蛋白表達 在 3000 m 組缺氧 12 h 后與常氧空白組比較差異無 統(tǒng)計學意義; 但在海拔 4500 m、6000 m、7500 m 缺氧 環(huán)境下 HIF-1α 蛋白表達逐步升高，并有顯著性差 異，進一步升高到 8000 m 時則有所下降。另一方 面，7500 m缺氧環(huán)境下，隨著缺氧暴露時間的延長， HIF-1α蛋白表達呈升高趨勢，缺氧 24 h、36 h、72 h 時，HIF-1α 蛋白表達水平可達到平臺期。說明隨著 缺氧海拔高度的升高，缺氧暴露時間的延長，7500 m 缺氧大于 24 h，HIF-1α 蛋白表達達到最大值，機體 缺氧損傷最嚴重。



 

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