奶牛分娩前 2 周至分娩后 10 d，其血漿中脂肪酸 濃度從平均 0. 2 mmol /L 增高至平均 0. 75 mmol /L， 患酮病的奶牛可達到 1 mmol /L 。脂肪酸代謝紊亂 不僅引起胰島素抵抗，而且影響細(xì)胞免疫。較 早的脂肪酸檢測方法常用氣相色譜法 ( GC)。由 于檢測溫度高，不飽和脂肪酸在檢測過程中易發(fā)生異 構(gòu)化，近年來開始應(yīng)用條件溫和的高效液相色譜法 ( HPLC) 對人體血清、血漿或紅細(xì)胞膜脂肪酸濃度 進行檢測。HPLC 分析奶牛血清中脂肪酸濃度的 方法尚未見報道。本文建立 HPLC 檢測奶牛血清中脂肪酸濃度的方法，可用于奶牛脂肪酸代謝的相關(guān) 研究。

1 材料與方法

1. 1 試驗動物

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院教學(xué)牧場臨床健康奶牛。

1. 2 試劑

對照品: 二十碳五烯酸 ( C20 ∶ 5，EPA，純度≥ 99%) 、豆蔻酸 ( C14 ∶ 0，純度≥99%) 、二十二碳 六烯酸 ( C22 ∶ 6，DHA，純度≥99%) 、花生四烯酸 ( C20 ∶ 4，AA，純度≥99%) 、亞油酸 ( C18 ∶ 2，純 度≥99%) 、棕櫚酸 ( C16 ∶ 0，純度≥99%) 、油酸 ( C18 ∶ 1，純度≥99%) 、正－十七烷酸 ( C17 ∶ 0，純 度≥99%) 、硬脂酸 ( C18 ∶ 0，純度≥99%) 、2－溴 苯乙酮 ( 分析純) 均購自北京雪杰特科技有限公司; 正庚烷 ( 分析純) 、冰醋酸 ( 分析純) 、甲醇 ( 色譜純) 、乙腈 ( 色譜純) ，均購自國藥集團化學(xué)試劑有 限公司; 三乙胺 ( 分析純) 、磷酸 ( 分析純) 、丙酮 ( 分析純) ，均購自北京化工廠。

1. 3 試劑配制

內(nèi)標(biāo)溶液: 稱取 C17 ∶ 0 約 12 mg，精密稱定， 置 10 mL 容量瓶中，用正庚烷溶解定容。對照品儲備 溶 液: 分 別 取 適 量 C20 ∶ 5、C14 ∶ 0、C22 ∶ 6、 C20 ∶ 4、C18 ∶ 2、C16 ∶ 0、C18 ∶ 1、C18 ∶ 0，精密 稱定，置不同容量瓶中，分別加正庚烷稀釋制成每 1 mL 約含 2. 8 mg 的單脂肪酸對照品儲備溶液。對照品 工作溶液: 精密量取 C20 ∶ 5 對照品儲備溶液 0. 13 mL、C14 ∶ 0 對照品儲備溶液 0. 05 mL、C22 ∶ 6 對照 品儲備溶液 0. 13 mL、C20 ∶ 4 對照品儲備溶液 0. 02 mL、C18 ∶ 2 對照品儲備溶液 0. 13 mL、C16 ∶ 0 對照 品儲備溶液 0. 1 mL、C18 ∶ 1 對照品儲備溶液 0. 2 mL、C18 ∶ 0 對照品儲備溶液 2 mL，置 25 mL 容量瓶 中，用正庚烷定容。2 mol /L 磷酸: 量取磷酸 0. 136 mL，加入適量純化水中，定容至 10 mL，即得。提取 液: 異丙醇－正庚烷－2 mol /L 磷酸 ( 80 ∶ 20 ∶ 2) 。20 mg /mL 2－溴苯乙酮丙酮溶液: 稱取 0. 20 g 2－溴苯乙 酮置 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容，即得。25 mg / mL 三乙胺丙酮溶液: 稱取 0. 25 g 三乙胺置 10 mL 容 量瓶中，用丙酮定容，即得。10 mg /mL 醋酸丙酮溶 液: 稱取 0. 1 g 醋酸置 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容 至刻度，即得。

1. 4 血漿脂肪酸提取

取 0. 25 mL 血清于 10 mL 離心管中，加入 25 μL 內(nèi)標(biāo)溶液和 1. 25 mL 提取液， 旋渦 10 min，隨后加入 1 mL 正庚烷和 0. 75 mL 水， 渦旋 5 min，以 4 500 r/min 離心 5 min，取上層正庚 烷溶液，置 4 mL 玻璃瓶中，離心管再加入 1 mL 正庚 烷，渦旋 5 min，以 4 500 r/min 離心 5 min，合并上 層正庚烷溶液，氮氣吹干，得樣品小瓶。

1. 5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取對照品工作溶液 50、100、200、 400、800 μL，置 4 mL 玻璃瓶中，分別加入 25 μL 內(nèi) 標(biāo)溶液，氮氣吹干，得標(biāo)準(zhǔn)曲線小瓶。

1. 6 脂肪酸的衍生化

取樣品小瓶或標(biāo)準(zhǔn)曲線小瓶，加入 2－溴苯乙酮 丙酮溶液 5 0 μL 及三乙胺溶液 50 μL，加入丙酮 300 μL，蓋緊螺旋蓋，震蕩 1 min，置 95 ℃ 干燥箱(上海精宏DHG-9247A)中反 應(yīng) 15 min，取出冷卻，加入 75 μL 醋酸丙酮溶液，震 蕩 1 min，置 95 ℃ 干燥箱中反應(yīng) 5 min，取出冷卻， 氮氣吹干，0. 5 mL 甲醇復(fù)溶，過微孔濾膜，置 1. 5 mL 上機小瓶中。

1. 7 色譜條件

色譜柱 Inert Sustain C18 ( 150 mm × 2. 1 mm，3 μm) 。流動相: A 液為乙腈，B 液為甲醇－水 ( 50 ∶ 50) ，0～30 min 乙腈的濃度為 52%，30～50 min 乙腈 的濃度從 52%升至 79%，50 ～ 60 min 乙腈的濃度從 79%升至 85%，60 ～ 65 min 乙腈的濃度從 85%升至 100%，保持 5 min，乙腈的濃度恢復(fù) 52%，平衡 20 min。流速: 0. 45 mL /min，檢測波長: 244 nm，柱 溫: 50 ℃。進樣體積: 10 μL。按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算 血清中脂肪酸含量。

1. 8 精密度試驗

精密量取 0. 25 mL 血清，按照 1. 4、1. 6、1. 7 方 法，平行做 5 次，由計算各脂肪酸濃度，計算相對標(biāo) 準(zhǔn)偏差 ( ＲSD) 。 1. 9 加樣回收率試驗 精密量取 0. 25 mL 血清，加入 100 μL 對照品工 作溶液，混勻，按照 1. 4、1. 6 、1. 7 方法，平行做 3 次，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算各脂肪酸濃度，計算回收率。

2 結(jié)果與分析

脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜和奶牛血清樣品色譜見圖 1。脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖中，8 種脂肪酸全部達 到基線分離。奶牛血清樣品色譜圖中，在 25. 694、 32. 050 min 存在 2 個未定義峰 ( 圖 1B 箭頭處) ，推 測可能分別是正 － 十二烷酸 ( C12 ∶ 0) 和亞麻酸 ( C18 ∶ 3) 。奶牛血清中，二十二碳六烯酸 ( C22 ∶ 6) 未檢出。

3 討論

脂肪酸沒有紫外吸收，使用紫外檢測器進行檢測要進行衍生化反應(yīng)。采用 2－溴苯乙酮作為衍生化 試劑，操作簡單方便，衍生化后產(chǎn)物穩(wěn)定，在 60 min 內(nèi)即可完全出峰。乙腈、丙酮和正己烷均是良好的衍 生化反應(yīng)介質(zhì)，水的存在將會導(dǎo)致反應(yīng)得率的降低， 本試驗采用干燥箱加熱的方法進行衍生化反應(yīng)。 Wood 等曾指出，過量的 2－溴苯乙酮可能會與 色譜柱內(nèi)的填料發(fā)生作用，或與其他任何富集于柱上 的帶羧基的化合物發(fā)生反應(yīng)而干擾色譜峰的檢測。因 此，衍生化后加入過量醋酸來破壞過剩的衍生劑是試 驗成功的關(guān)鍵之一。